Bakteriofag

Informacje ogólne

Wirus infekujący wyłącznie komórki prokariotyczne (wirus bakteryjny, pasożyt bakteryjny) charakteryzujący się swoistością działania i wykazujący aktywność lityczną wobec danego gatunku, a nawet szczepu bakteryjnego (gospodarza), mający zdolność do amplifikacji w komórkach gospodarza. Bakteriofagi to najbardziej zróżnicowana i najliczniejsza grupa wirusów, które występują powszechnie w środowisku (wody, gleba, ścieki, produkty spożywcze, mikroorganizmy, organizmy ludzi oraz zwierząt). Szacuje się, że ich liczebność w biosferze 10–krotnie przekracza liczbę komórek bakteryjnych. Oprócz ograniczania liczebności bakterii odgrywają także ważną rolę w ich ewolucji.

Budowa i cykl życiowy

Fagi zbudowane są z kwasu nukleinowego zawartego w białkowej otoczce. Pojedyncza cząstka fagowa (wirion) składa się z główki i ogonka. Może mieć różne kształty, a ich morfologia jest cechą systematyczną. Główkę tworzy kapsyd, wewnątrz którego znajduje się materiał genetyczny. Kapsyd to element składowy wirionu fagowego zbudowany z białek zwanych kapsomerami, tworzących uporządkowaną strukturę, co nadaje kształt cząstce fagowej. Może być helikalny, izometryczny lub złożony, łączący wsobie obie formy Stanowi ochronę dla kwasu nukleinowego wirusa. Kapsyd helikalny zbudowany jest ze spiralnie ułożonych podjednostek białkowych. Składa się on zjednego głównego białka kapsydu iczterech białek, zlokalizowanych na jego końcach, występuje u bakteriofagów zrodziny Inoviridae. Kapsyd izometryczny ma symetrię dwudziestościenną, tzn. na jej dwudziestu równobocznych powierzchniach znajduje się około 60 identycznych elementów ułożonych wformie kulistej, połączonych ze sobą podwójną, trójkrotną ipięciokrotną osią symetrii, występuje u bakteriofagów zrodziny Microviridae. Kapsyd ostrukturze złożonej zbudowany jest zwielościennej główki iogonka. Głowa zbudowana jest zjednego lub kilku typów białek ima za zadanie ochronę kwasu nukleinowego, który znajduję się wjej wnętrzu. Wdolnej części główki kapsyd przechodzi wogonek, który jest połączony zgłówką za pomocą białka łącznikowego. Składa się zwewnętrznej tubularnej struktury rdzeniowej, otoczonej kurczliwą, helikalną pochewką, przez którą następuje transfer kwasu nukleinowego podczas infekcji. Większość ogonków posiada włókna lub kolce. Krótsze przydatki nazywane są kolcami ogonów (np. Podoviridae) lub wąsami. Ogonki bakteriofagów zbudowane są z podjednostek, mogą różnić się długością, kurczliwością, występowaniem osłonki. Występują w trzech różnych formach morfologicznych: krótkie (np. fag T7), długie kurczliwe (fag Mu), długie niekurczliwe (fag λ). Ogonek fagów z rodziny Myioviridae (24,5% ogonów)
jest kurczliwy i składa się z osiowej igły otoczonej kurczliwą pochewką, oddzielona od główki faga pustą przestrzenią lub tzw. „szyją”. Ogonki fagów z rodziny Siphoviridae (61%) to długie i elastyczne lub sztywne rurki, podczas gdy u Podoviridae (14%) są krótkie o długości 10–20 nm. Kurczliwe ogonki fagów ulegają zmianie konformacyjnej - przypominającej działanie strzykawki - po przyłączeniu do komórki gospodarza. Bakteriofagi ogonkowe, które stanowią najliczniejszą grupę wirusów, wykorzystują swój kurczliwy ogonek do wstrzyknięcia materiału genetycznego do wnętrza komórki bakteryjnej, np. T4, T7 posiadają stabilne kapsydy z wierzchołkowo umieszczonymi białkowymi ogonkami. Następuję adsorpcja do komórki bakteryjnej i wytwarzane są pory w jej ścianie komórkowej, z udziałem endolizyn oraz holin, które umożliwiają endolizynie dostęp do peptydoglikanu budującego ścianę komórkową bakterii. Fag wstrzykuje swoje DNA do wnętrza komórki bakterii, pusty kapsyd wirusowy pozostaje na zewnątrz. Ogonek zakończony jest płytką podstawy, wktórą wbudowane są białka enzymatyczne degradujące ścianę komórkową bakterii. Od płytki podstawy odchodzi sześć nitkowatych wypustek, które służą do rozpoznawania odpowiednich receptorów oraz adsorpcji faga do powierzchni komórek bakterii. Taką strukturę posiadają bakteriofagi rodzin Myoviridae, Siphoviridae iPodoviridae.Cykl życiowy bakteriofagów, czyli cykl, w wyniku którego dochodzi do infekcji komódki bakteryjnej fagiem, powstają i uwalniane są do otoczenia fagowe wiriony potomne. W zależności od efektu końcowego infekcji fagowej można wyróżnić cykl lityczny- w którym cząstka fagowa przyłącza się do swoistych receptorów na powierzchni komórki bakteryjnej, a materiał genetyczny jest wstrzykiwany do wnętrza. Dochodzi do replikacji fagowego kwasu nukleinowego, po czym powstają białka fagowe i składany jest kapsyd, do którego upakowany zostaje materiał genetyczny faga. Kompletne wiriony potomne są uwalniane do otoczenia powodując przy udziale endolizyn i holin rozpad (lizę) komórki bakteryjnej. Cykl ten składa się z następujących etapów: adsorpcja, penetracja, replikacja, składanie, uwalnianie; oraz- cykl lizogeniczny, w którym dochodzi do syntezy białka represorowego, w efekcie czego materiał genetyczny faga zostaje wbudowany w materiał genetyczny komórki bakteryjnej i razem z nim podlega replikacji (profag). Taki stan nazywany jest lizogenią, Pewne warunki, np. niekorzystne czynniki środowiska mogą przyczynić się do indukcji profaga i spowodować wejście faga w cykl lityczny. Fag realizujący cykl lityczny, którego efektem działania jest zniszczenie komórki bakteryjnej gospodarza to fag lityczny, zjadliwy. Fagi lityczne zaleca się do stosowania w terapii fagowej. Z kolei jako faga łagodnego określa się bakteriofaga w cyklu lizogenicznym, którego materiał genetyczny jest zintegrowany ulega replikacji z genomem bakteryjnego gospodarza (lizogenu) lub pozostaje w formie plazmidu. To postać nieinfekcyjna bakteriofaga, która może występować przez wiele pokoleń bakterii, którego geny nie podlegają ekspresji, lecz w pewnych warunkach może dojść do indukcji progafa i jego materiał genetyczny może zostać wycięty z DNA bakterii wchodząc w cykl lityczny, niszcząc i infekując inne komórki bakteryjne. Komórka bakteryjna zainfekowana profagiem nie jest wrażliwa na infekcje nowymi cząstkami faga, którym jest zainfekowana. Uważa się, że fagi łagodne mogą stanowić wektor w procesie horyzontalnego transferu genów. W szczególności biorą udział w procesie transdukcji polegającym na przeniesieniu fragmentu DNA z jednej komórki do drugiej, będący rezultatem infekcji bakteriofagiem. Proces polega na tym, że na etapie składania wirionów potomnych dochodzi do przypadkowego wycięcia i upakowania fragmentu DNA pochodzącego z komórki gospodarza, a następnie zostaje on wbudowany do genoforu innej komórki bakteryjnej na drodze rekombinacji. Bakteriofagi mogą przenosić geny powodujące zmianę fenotypu komórki gospodarza, takie jak, m in.: odpowiadające za zjadliwość bakterii- np. produkcję toksyn, czy geny oporności na antybiotyki. Z tego względu fagi łagodne nie są zalecane do zastosowania w celach terapeutycznych.

Morfologia i ultrastruktura

Budowa zewnętrzna – morfologia pojedynczej cząstki fagowej ustalana jest na postawie obrazu uzyskanego w Tranmisyjnym Mikroskopie Elektronowym. Wiriony fagów mogą być ogonkowe, wielościenne, filamentowe lub wielokształtne. Fagi ogonkowe stanowią najliczniejszą grupę zawierającą ponad 4950 opisanych bakteriofagów. Zostały one sklasyfikowane jako rząd Caudovirales. W skład rzędu wchodzi 13 rodzin wyróżnionych na podstawie budowy wirionu i stanowiące 21 tzw. morfotypów (A-G) opisanych przez H.W. Ackermanna na postawie obserwacji fagów z użyciem Transmisyjnej Mikroskopii Elektronowej. Wirusy bakteryjne nieposiadające ogonka wytwarzają fosfolipidy, wykorzystywane w przekazywaniu swojego materiału genetycznego. Główki fagów mogą być m.in. wielościenne, cylindryczne, sferyczne czy o kształcie wrzeciona. Oprócz zróżnicowanego kształtu fagi różnią się także pod względem wielkości. Średnia długość wirionu fagowego mieści się w przedziale 30-60nm. W niektórych ekosystemach wodnych można jednak spotkać fagi mniejsze niż 30 nm. Istnieją także bakteriofagi o wielkości 200-300 nm. Budowę pojedynczych wirionów fagowych uzyskanych w wyniku zastosowania Transmisyjnej Mikroskopii Elektronowej. Ze względu na rozmiary fagów, wiriony fagowe, jak i elementy ich budowy można obserwować jedynie przy pomocy Mikroskopii Elektronowej, dzięki czemu możliwe jest zaobserwowanie kształtu całej cząstki fagowej, jej rozmiarów, kształtu i symetrii główki, obecności i długości ogonka, płytki podstawy oraz odchodzących od niej włókien.

Zastosowanie bakteriofagów

Terapeutyczne: wykorzystujące zdolność fagów do swoistego niszczenia bakterii wywołujących infekcje, w przypadku których dostępne antybiotyki okazują się nieskuteczne- eksperymentalna terapia fagowa prowadzona przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu. Dotychczasowe badania wskazują na to, że fagi są cząstkami naturalnymi, bezpiecznymi, nie wywołującymi ciężkich efektów niepożądanych, nietoksycznymi dla nerek i wątroby, które mogą by stosowane u pacjentów z niedoborami odporności. Wykazano, że fagi mogą być aktywne zarówno wobec bakterii w postaci planktonicznej, jak i występujących w biofilnie. Potencjał terapeutyczny charakteryzuje również endolizyny fagowe, enzymy produkowane i uwalniane w końcowym etapie cyklu litycznego. W celach terapeutycznych wykorzystywane są preparaty fagowe w postaci lizatów lub preparatów fagów oczyszczonych, zawierające wyłącznie fagi lityczne. Do poszukiwania fagów aktywnych wobec wyizolowanych szczepów bakteryjnych stosuje się tzw. metodę typowania fagowego w której jako wynik pozytywny uznawana jest obecność tzw. łysinek fagowych, czyli stef zahamowania wzrostu obserwowanych jako drobne przejaśnienia na powierzchni murawy bakteryjnej w hodowli stałej. Powstają one w wyniku lizy komórek (rozpadu komórek bakteryjnych), będącej efektem działania bakteriofagów lub enzymów przez nie produkowanych. Mogą też być efektem działania czynników niespecyficznych, hamujących wzrost komórek bakteryjnych. Łysinki fagowe mogą być cechą charakterystyczną dla danego faga, mogą mieć różną średnicę, różny brzeg, być przejrzyste lub nie oraz z tzw. efektem halo. Do określania miana fagów w badanej próbce wykorzystywana jest metoda płytek dwuwarstwowych. oraz metoda standardowych rozcieńczeń. Miano fagów w badanej próbce podaje się jako liczbę jednostek tworzących łysinki (pfu - ang. plaque forming units- jednostki tworzące łysinki). Do celów terapeutycznych fagów poszukuje się w różnorodnym materiale, po uzyskaniu lizy na powierzchni murawy bakteryjnej wycina się fragment agaru w miejscu gdzie zaszła liza i podejmuje się próbę reizloacji i amplifikacji potencjalnego faga. Nowo wyizolowane fagi, zanim zostaną włączone do kolekcji i będą wykorzystywane do celów terapeutycznych muszą być gruntownie scharakteryzowane. Określa się dla fagów: spektrum lityczne, swoistość gatunkową, MOI, miano faga, stopień adsorpcji do komórki bakteryjnej, okres latencji, morfologię łysinek i ich wielkość, stabilność w warunkach przechowywania, morfologię i ultrastrukturę wirionów fagowych dzięki obrazowaniu z użyciem Tranmisyjnej Mikroskopii Elektronowej (TEM), sekwencję genomu. Genom fagowy jest sprawdzany pod kątem obecności genów kodujących toksyny, genów oporności na antybiotyki oraz integraz.

Fagi izolowane są z materiału w którym występuje ich bakteryjny gospodarz. Źródło fagów mogą stanowić zarówno próbki środowiskowe: woda, gleba jak i kliniczne- izolaty, kał, ślina, treść jelitowa. Jednak za najbardziej bogate źródło fagów uważa się ścieki szpitalne.

Inne właściwości/ zastosowania fagów

• Działanie immunomodulacyjne
• Ochrona żywności
• Ochrona zwierząt i leczenie zakażeń bakteryjnych
• Narzędzie współczesnej biotechnologii imedycyny
• Wykrywanie patogenów w badanym materiale
• Ochrona przed zastosowaniem broni biologicznej